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    简要描述:

    RNAi干扰检测 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

    浏览量:1038

    更新时间:2022-09-26

          RNAi干扰检测 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默,主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

      RNAi干扰检测 主体实验:
      一、成功将siRNA表达载体导入目的细胞
      如果目的细胞的质粒转染效率较低(低于70%),则应采用腺病毒或慢病毒载体,利用病毒载体的高感染率、高表达特性,更好地开展RNA干扰主体实验。
      二、设置好分组和对照
      按照nature的标准,一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照:
      ⒈转染试剂对照(监控转染及培养条件对结果的影响);
      ⒉nonsense siRNA对照(监控外源核酸本身对结果的影响);
      ⒊positive siRNA对照(监控假阴性);
      ⒋技术重复对照(也叫off-target 对照,也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验,2个siRNA互为off-target control,当两者的表型相同时,才有可能是特异性的knockdown效应);
      ⒌rescue 对照(knockdown之后做超表达,看是否有性状的逆转,这也是为了说明knockdown的特异性);6.全表达组扫描对照(就是转录/表达芯片扫描,以zui终确定表型不是由于off-target造成)。
      实际实验中,全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中,1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照,基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照,主要是为了解决off-target效应,选做一种即可,一般建议选5,涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”,
      三、RNA干扰效率的检测(体外)
      一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。
      mRNA水平:RT-PCR、Real-time PCR;蛋白质水平:Western-blot、ELISA、免疫组化;细胞表型水平:MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证(体内) 动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
      体内法,即先做裸鼠成瘤模型,再将质粒或病毒导入裸鼠,检测RNA干扰效果。此法操作复杂,对质粒和病毒产品的质和量要求都较高,但是比较贴近实际,说服力较显著。体外法,即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞,再将肿瘤细胞导入动物体内,然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单,对质粒和病毒产品的质量要求较低,所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。

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